Գենետիկական ուսումնասիրությունների ընթացքում մենք հաճախ հանդիպում ենք ՌՆԹ-ի անբավարար նմուշների, օրինակ՝ բերանի խոռոչի փոքրիկ անատոմիական ուռուցքների, նույնիսկ միաբջիջ նմուշների և գենային հատուկ մուտացիաների նմուշների, որոնք տառադարձվում են մարդու բջիջներում շատ ցածր մակարդակով:Իհարկե, COVID-19 թեստի համար, եթե անձեռոցիկները ճիշտ տեղում չեն կամ նմուշառման ընթացքում բավականաչափ ժամանակ չկա, ապա ընտրանքի չափը շատ ցածր կլինի, ինչի պատճառով Առողջապահության և ընտանիքի պլանավորման հանձնաժողովը երկու օր առաջ դուրս եկավ և անցել է թեստը, և եթե նուկլեինաթթվի նմուշառումը վեց նմուշ չի վերցրել, կարող եք հայտնել դրա մասին:
Ռեագենտի զգայունությունը կարևոր է, քանի որ մենք ունենք այս կամ այն խնդիրը, ուստի ի՞նչ կարող ենք անել RT-PCR-ի զգայունությունը բարելավելու համար:
Նախքան հնարավոր լուծումների քննարկումը, նշենք երկու մեծ բարդություն մեր նոր նշած իրավիճակի հետ կապված։
Առաջին հերթին մենք անհանգստանում ենք ՌՆԹ-ի կորստի համար, երբ մեր նմուշում ունենք միայն մի քանի բջիջների պոպուլյացիա:Եթե օգտագործվում են տարանջատման և մաքրման ավանդական մեթոդներ, ինչպիսիք են սյունակային մեթոդը կամ նուկլեինաթթվի տեղումների եղանակը, մեծ հավանականություն կա, որ մի քանի նմուշներ կկորչեն:Լուծումներից մեկը կրող մոլեկուլ ավելացնելն է, ինչպիսին է tRNA-ն, բայց նույնիսկ այդ դեպքում երաշխիք չկա, որ մեր վերականգնման փորձը նորմալ է:
Այսպիսով, ո՞րն է ավելի լավ միջոց:Կուլտուրացված բջիջների կամ միկրոանատոմիական նմուշների համար լավ տարբերակ է ուղղակի լիզի օգտագործումը:
Գաղափարն այն է, որ բջիջները բաժանվեն 5 րոպեով, արձակեն ՌՆԹ-ն լուծույթի մեջ, այնուհետև դադարեցնեն ռեակցիան 2 րոպեով, այնուհետև լիզատը ուղղակիորեն ավելացնել հակադարձ տրանսկրիպցիոն ռեակցիային, որպեսզի ոչ մի ՌՆԹ չկորչի, և վերջապես ստացված cDNA-ն ուղղակիորեն տեղադրվի: իրական ժամանակի ռեակցիայի մեջ:
Բայց ի՞նչ, եթե սահմանափակ ելակետի կամ թիրախային գենի փոքր քանակի պատճառով մենք կարողանանք վերամշակել ամբողջ ՌՆԹ-ն և դեռևս բավարար ձևանմուշներ չտրամադրել իրական ժամանակում լավ ազդանշան ստանալու համար:
Այս դեպքում, նախնական ուժեղացման քայլը կարող է շատ օգտակար լինել:
Հետևյալը հակադարձ արտագրումից հետո զգայունության բարձրացման սխեմա է:Նախքան սկսելը, մենք պետք է հարցնենք, թե որ թիրախներն են մեզ հետաքրքրում, որպեսզի նախագծենք հատուկ այբբենարաններ այս թիրախների համար նախնական ուժեղացման համար:
Դրան կարելի է հասնել՝ ստեղծելով խառը այբբենարան մինչև 100 զույգ այբբենարաններով և 10-ից 14 անգամ արձագանքման ցիկլով:Հետևաբար, այս պահանջի համար հատուկ մշակված Master Mix-ը անհրաժեշտ է՝ ստացված cDNA-ն նախապես ուժեղացնելու համար:
10-ից 14 ցիկլերի թիվը սահմանելու պատճառն այն է, որ ցիկլերի այս սահմանափակ քանակն ապահովում է տարբեր թիրախների միջև պատահականություն, ինչը կարևոր է քանակական մոլեկուլային տեղեկատվության կարիք ունեցող հետազոտողների համար:
Նախնական ուժեղացումից հետո մենք կարող ենք մեծ քանակությամբ cDNA ստանալ, որպեսզի հետևի հայտնաբերման զգայունությունը զգալիորեն բարելավվի, և մենք կարող ենք նույնիսկ նոսրացնել նմուշը և իրական ժամանակում իրականացնել բազմաթիվ PCR ռեակցիաներ՝ հնարավոր պատահական սխալները վերացնելու համար:
Հրապարակման ժամանակը՝ ապրիլի 11-2023